Tag Archives: дифтерийный токсин
Клеточная модель для исследования рецепторной и регуляторной функций proHB EGF человека
Н. В. Короткевич, А. Ю. Лабынцев, К. Ю. Манойлов, О. И. Крынина,
Л. В. Дяченко, Д. В. Колибо, С. В. Комисаренко
Інститут биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев;
e-mail: gnr.nata@gmail.com
Исследование внутриклеточных путей транспортирования proHB-EGF, а также его лиганд-рецепторных комплексов, требует создания новейших подходов и моделей, в частности, с использованием флуоресцентных техник. С целью создания модели для исследования функций proHB-EGF было получено генетическую конструкцию pEGFP-N1-proHB-EGF, которая кодирует протеин proHB-EGF-EGFP–proHB-EGF, слитый с усиленным зеленым флуоресцентным протеином EGFP на цитоплазматическом конце молекулы. Путем трансфекции pEGFP-N1-proHB-EGF были получены эукариотические клетки линии Vero, экспрессирующие на поверхности протеин proHB-EGF-EGFP. Экспрессированный в клетках эукариот proHB-EGF-EGFP обладал способностью связывать нетоксичное флуоресцентное производное рецепторной субъединицы В дифтерийного токсина mCherry-SubB. После стимулирования трансфицированных клеток ТРА (12-0-тэтра-деканоилфорбол-13-ацетат), proHB-EGF-EGFP образовывал флуоресцентно-меченый С-терминальный фрагмент молекулы – CTF-EGFP. Таким образом, полученная генетическая конструкция pEGFP-N1-proHB-EGF позволяет визуализировать молекулы proHB-EGF и CTF в клетках. Это открывает новые возможности для исследования их функций, в частности, рецепторной функции proHB-EGF при связывании с молекулой дифтерийного токсина, исследований внутриклеточных путей транспортировки CTF и для поиска новых лигандов proHB-EGF.
Роль Т-домена дифтерийного токсина во внутриклеточном транспорте токсинсодержащих везикул
А. Ю. Лабынцев, Д. В. Колибо, Е. С. Юрченко, А. А. Кабернюк,
Н. В. Короткевич, С. В. Комисаренко
Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев;
е-mail: lab.andrey@gmail.com
Субъединица В дифтерийного токсина (ДТ), которая состоит из двух доменов, R – рецепторного и Т – трансмембранного, играет важную роль в связывании токсина с рецептором на клетках-мишенях и в транспорте каталитической субъединицы А в цитозоль. Рекомбинантные аналоги субъединицы В являются перспективными представителями уникального класса транспортных протеинов, которые способны обеспечить доставку биологически активных молекул в цитозоль клеток. Создание таких конструкций требует определения роли каждого из фрагментов ДТ в транспортировании поглощенного комплекса рецептор–токсин.
В работе исследовали роль Т-домена во внутриклеточном транспорте рекомбинантных фрагментов ДТ. Для этого сравнивали особенности внутриклеточного транспортирования R-домена и субъединицы В, которая содержала как R-, так и Т-домен ДТ. Рекомбинантные фрагменты ДТ метили флуоресцентными протеинами, что позволило использовать в исследовании технику колокализации. Методом конфокальной микроскопии показаны отличия в транспортировании рекомбинантных производных ДТ в клетках линии Vero. Показано, что R-домен быстрее, чем субъединица В, попадает в тубулярные компартменты клетки. Анализ колокализации R-домена и субъединицы В подтверждает почти линейный ее рост согласно с коэффициентом Пирсона (PCC) при увеличении времени инкубации. Однако процент субъединицы В, которая колокализирована с R-доменом, определенный по коэффициенту Мандерса (M1), рос нелинейно, что может свидетельствовать о способности субъединицы В попадать в определенные компартменты клетки, недоступные для R-домена. Роль Т-домена во внутриклеточном транспорте и компартментализации токсина, вероятно, связана с его способностью к формированию протонных каналов и взаимодействию с комплексом протеинов цитоплазмы COPI.