Tag Archives: конфокальная микроскопия
Роль Т-домена дифтерийного токсина во внутриклеточном транспорте токсинсодержащих везикул
А. Ю. Лабынцев, Д. В. Колибо, Е. С. Юрченко, А. А. Кабернюк,
Н. В. Короткевич, С. В. Комисаренко
Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев;
е-mail: lab.andrey@gmail.com
Субъединица В дифтерийного токсина (ДТ), которая состоит из двух доменов, R – рецепторного и Т – трансмембранного, играет важную роль в связывании токсина с рецептором на клетках-мишенях и в транспорте каталитической субъединицы А в цитозоль. Рекомбинантные аналоги субъединицы В являются перспективными представителями уникального класса транспортных протеинов, которые способны обеспечить доставку биологически активных молекул в цитозоль клеток. Создание таких конструкций требует определения роли каждого из фрагментов ДТ в транспортировании поглощенного комплекса рецептор–токсин.
В работе исследовали роль Т-домена во внутриклеточном транспорте рекомбинантных фрагментов ДТ. Для этого сравнивали особенности внутриклеточного транспортирования R-домена и субъединицы В, которая содержала как R-, так и Т-домен ДТ. Рекомбинантные фрагменты ДТ метили флуоресцентными протеинами, что позволило использовать в исследовании технику колокализации. Методом конфокальной микроскопии показаны отличия в транспортировании рекомбинантных производных ДТ в клетках линии Vero. Показано, что R-домен быстрее, чем субъединица В, попадает в тубулярные компартменты клетки. Анализ колокализации R-домена и субъединицы В подтверждает почти линейный ее рост согласно с коэффициентом Пирсона (PCC) при увеличении времени инкубации. Однако процент субъединицы В, которая колокализирована с R-доменом, определенный по коэффициенту Мандерса (M1), рос нелинейно, что может свидетельствовать о способности субъединицы В попадать в определенные компартменты клетки, недоступные для R-домена. Роль Т-домена во внутриклеточном транспорте и компартментализации токсина, вероятно, связана с его способностью к формированию протонных каналов и взаимодействию с комплексом протеинов цитоплазмы COPI.
Модуляция мембранного потенциала митохондрий миометрия антагонистами кальмодулина
С. Г. Шлыков, Л. Г. Бабич, М. Е. Евтушенко, С. А. Карахим, С. А. Костерин
Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев;
e-mail: sshlykov@biochem.kiev.ua
Влияние антагонистов кальмодулина – кальмидазолиума и трифлуоперазина – на мембранный потенциал митохондрий исследовали с использованием метода проточной цитометрии, конфокальной микроскопии, применяя флуоресцентные зонды TMRM и MTG. Установлено, что антагонист кальмодулина кальмидазолиум в концентрациях от 1 до 10 мкМ дозозависимо снижает мембранный потенциал митохондрий. В то же время, трифлуоперазин в концентрации от 10 до 100 мкМ действует разнонаправленно – в концентрации 10 мкМ увеличивает поляризацию, тогда как в концентрации 100 мкМ вызывает практически полную деполяризацию митохондриальных мембран. Методом конфокальной микроскопии на клетках миометрия показано, что внесение в среду инкубации MTG приводит к появлению флуоресценции в «зеленом» диапазоне. Внесение второго зонда ТМRM приводит к появлению флуоресценции в «красном» диапазоне. Деполяризация митохондрий протонофором СССР и 10 мМ NaN3 сопровождается снижением интенсивности «красной» флуоресценции, при этом «зеленая» флуоресценция сохраняется. Внесение в среду инкубации 10 мкМ кальмидазолиума или 100 мкМ трифлуоперазина через 10–15 мин инкубации приводит к практически полному гашению флуоресценции зонда ТМRM. Таким образом, при использовании потенциалчувствительных флуоресцентных зондов TMRM и MTG продемонстрировано, что антагонисты кальмодулина модулируют мембранный потенциал митохондрий клеток миометрия.